GS組織標本固定脫水系列套裝試劑在全自動組織處理機中的應用體會

GS組織標本固定脫水系列套裝試劑

在全自動組織處理機中的應用體會

何金朱維健徐毅王淵

第二軍醫大學長征醫院病理科

采用甲醛固定、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋和切片、蘇木精—伊紅染色的常規病理技術自創建以來已有100多年的歷史，至今仍在臨床病人和醫學研究中廣泛應用。在傳統的石蠟切片制作和染色中要廣泛應用到甲醛和二甲苯，我們知道甲醛、二甲苯均是無色透明的化學試劑，它易揮發、具有高度的刺激性和腐蝕性，國內外醫學研究以證明，人體皮膚直接接觸甲醛、二甲苯會引起過敏反應、皮膚炎或濕疹，長期接觸的人群，其體內白細胞數量明顯下降，嚴重時可能會引起慢性呼吸系統疾病、癌癥發生，如鼻咽癌、結腸癌、腦瘤、白血病，還會導致記憶力和智力下降。因此在2004年WHO正式宣布甲醛、二甲苯為致癌物質，同時提醒人們要重視其致癌性，并采取預防措施。

近年來隨著人們環保意識的增強，對生存環境和生活質量都有了更高的追求。廣大病理工作者也更加意識到常規工作中使用的甲醛和二甲苯存在著對職業工作環境和排放后生活環境的毒害和污染。哈爾濱格林標本技術開發有限公司順應民意和市場需求，在2008年研究了一套替代技術取代石蠟包埋切片技術中甲醛和二甲苯毒害試劑的使用，并且通過多項毒理學實踐和多家醫院的試用鑒定。在2009年全國病理技術進展和應用研討會上，北京大學人民醫院董建強老師在大會上介紹《格林標本——新一代環保型病理組織標本固定脫水透明試劑試用報告》，參會人員對此事都很感興趣，為此2010年1月在無錫召開的上海市病理技術年會特地邀請董堅強和王德田二位老師給大家作了生動、精彩、詳細的專題報告，我們對GS標本試劑有了更多的了解，也增加了我們使用環保試劑的信心，在2010年3月份選擇將GS標本組織固定脫水套裝試劑引入到我院的常規工作中使用。

1. 材料和方法

1.1 標本

******周初期試用時選用較大的外科手術切除標本107例，經中******爾馬林固定后在同一病變部位各取材兩塊，一組采用傳統酒精、二甲苯脫水透明的方法；另一組采用環保試劑脫水透明的方法。第二周開始大批量應用于臨床送檢的各種活體組織病理標本，每天將常規取材的102個組織塊放入采用格林組織固定脫水套裝試劑的全自動組織處理機進行脫水透明浸蠟，連續使用了24周，共處理了12240個組織塊。

1.2 試劑

選用GS標本組織固定脫水套裝試劑代替傳統脫水機中使用的酒精、二甲苯，該套裝試劑中包含組織固定劑、組織脫水劑Ⅰ、組織脫水劑Ⅱ、組織透明劑、浸蠟Ⅰ、浸蠟Ⅱ 6種試劑。

1.3 方法

1.3.1 傳統酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟制片法組織經常規10%中******爾馬林固定，取材后將組織塊放入SHANDON全自動組織處理機，常規處理程序如下，（1）95%酒精0:30；（2）95%酒精0:30；（3）95%酒精0:30；（4）純酒精1:00；（5）純酒精1:00；（6）純酒精1:00；（7）純酒精1:30；（8）純酒精2:00；（9）二甲苯0:30；（10）二甲苯0:30；（11）蠟A 0:30；（12）蠟B 0:30；（13）蠟C 0:30；（14）蠟D 1:30。常規石蠟包埋，切片厚4微米。

1.3.2 初期試用時格林組織固定脫水套裝試劑制片法在初期試用時同一例組織經常規10%中******爾馬林固定，在同一病變部位取材后將另一個組織塊放入裝有GS標本組織固定脫水套裝試劑的另一臺SHANDON全自動組織處理機，組織處理程序如下：（1）組織固定劑 1:00；（2）組織固定劑3:00；（3） 70%酒精0:05；（4）95%酒精0:05；（5）組織脫水劑Ⅰ0:30；（6）組織脫水劑Ⅰ1:00（7）組織脫水劑0:30；（8）組織脫水劑Ⅱ 1:00；（9）組織透明劑1:00；（10）組織透明劑 1:30；（11）浸蠟|0:45；（12）浸蠟| 0:50；（13）浸蠟Ⅱ0:50；（14）浸蠟|| 1:00.常規石蠟包埋，切片厚4微米。

1.3.3 大批量應用時GS標本組織脫水套裝試劑制劑方法第二周開始每天將日取材的102個組織放入裝有GS標本組織固定脫水套裝試劑的另一臺SHANDON全自動組織處理機，組織處理程序如下：（1）組織固定劑 1:00；（2）組織固定劑2:00；（3）95%酒精0:15；（4）純酒精0:15；（5）組織脫水劑Ⅰ0:40；（6）組織脫水劑Ⅰ 1:20（7）組織脫水劑Ⅱ0:40；（8）組織脫水劑Ⅰ 1:20；（9）組織透明劑1:00；（10）組織透明劑1:30；（11）浸蠟Ⅰ0:45；（12）浸蠟Ⅰ0:50；（13）浸蠟Ⅱ0:50；（14）浸蠟Ⅱ 1:00.常規石蠟包埋，切片厚4微米。

1.3.4 全自動HE染色方法所有石蠟切片常規烤片后均用LeicaAUTOSTAINER XL進行全自動HE染色，染色程序如下：（1）烘烤玻片2:00min；（2）脫蠟二甲苯Ⅰ 5:00min；（3）脫蠟二甲苯Ⅱ 5:00min；（4）脫蠟二甲苯Ⅲ 3：00min；（5）純酒精0:30min；（6）95%酒精Ⅰ 0:30min；（7）95%酒精Ⅱ0:20min；（8）70%酒精0:20min；（9）流水沖洗1:30min；（10）蘇木精4:00min；（11）流水沖洗0:45min；（12）1%鹽酸酒精0:02min； (13)流水沖洗0:45min；（14）溫水藍化0:30min；（15）伊紅染色0:03min；（16）純酒精Ⅰ0:20min；（17）純酒精Ⅱ0:20min；（18）純酒精Ⅲ 0:20 min；（19）純酒精Ⅳ0:20min；（20）石炭酸二甲苯0:45min；（21）二甲苯|0:20min；（22）二甲苯Ⅱ0:20min；（23）二甲苯Ⅲ0:20min；（24）退出。取出切片后常規中性樹膠封片。

2. 結果

2.1 同一例標本二種不同脫水方法的HE染色比較同一例標本采用二種不同脫水方法的組織塊在包埋時就感覺到不一樣，常規脫水、透明的組織塊脆硬，包埋時易碎裂；GS標本組織固定脫水套裝試劑處理的組織塊軟硬適中便于包埋。在切片時不論組織大小環保試劑處理的組織塊也更好切，特別是肌瘤、皮膚和骨組織等堅硬的組織塊比常規脫水的組織塊更容易切片。同一例標本二種不同脫水方法的切片同一染色架進行HE染色，GS組織標本固定脫水套裝試劑處理的切片組織紅藍適度、核漿對比分明，色彩鮮艷、結構顯示清晰，明顯優于傳統方法制片的HE染色（圖）。

2.2 同一例標本二種不同脫水方法的組織切片免疫組化染色比較在107例標本中有胃癌、食管癌、腎癌、肝癌、腸癌、乳腺癌、膠質瘤、淋巴瘤等26例，對其進行了38項抗體共176個指標的免疫組化對比染色，兩者免疫組化染色結果是相符的，無論是陽性表達部位還是陽性細胞數都沒有明顯差別，部分GS標本組織固定脫水套裝試劑處理的切片免疫組化結果陽性細胞表達顯著、定位準確、背景也清晰，要優于常規脫水處理的切片（圖）。

2.3 大批量應用于格林標本組織固定脫水套裝試劑制片結果經過一周107例標本二種不同脫水方法的組織切片HE染色和免疫組化染色比較，3位教授和2位主治醫師閱片后一致認為均優于常規脫水的切片，于是展開了24周的GS標本組織固定脫水套裝試劑大批量應用，每天將上午取材的102個組織塊放入裝有GS組織標本固定脫水套裝試劑的另一臺SHANDON全自動組織處理機，無論是HE染色還是免疫組化染色都取得了滿意的結果，日常病理診斷工作未受任何影響（圖）。

3. 討論

進入21世紀的今天，人類的進步和城市的發展已到了一個新的高度，人們對健康和環境也有了更高的要求，為了社會的可持續發展，也更加認識到環保的重要性。減少或完全替代甲醛和二甲苯毒害試劑的應用，建立一套替代技術取代石蠟包埋切片中毒害試劑的使用是一項意義重大的工作，它不僅是我們每個病理工作者的追求的愿望，也是我們對社會應盡的義務。國內目前見有TO、VAN-CLEAR、WAX-OUT、益利、長島、宏茲、江源等多種二甲苯替代產品試用報道，其性能各有優劣，但缺乏大標本量的使用報告。哈爾濱格林標本技術開發有限公司經過長時間的研究探索，終于開發出了******首創的全新病理技術平臺組織固定脫水套裝試劑，它是國內******個專業廠家推出的******套環保型套裝系列試劑。該試劑經過毒理學實驗和大中型醫院試用鑒定，各方面反響均不錯，我們在2010年3月也加入到這項有意義的工作中來。

雖然我們聽過董老師的二次報告后，對哈爾濱格林標本技術開發有限公司的環保試劑有了深入的了解，但對GS組織標本固定脫水系列套裝試劑還是將信將疑。剛開始試用時相當謹慎，畢竟酒精脫水、二甲苯透明的常規石蠟切片已有一百多年的歷史，GS組織環保試劑脫水透明的組織制片是否優于傳統制片方法也一直有疑問，我們就決定采用較大標本的同一例組織同一病變部位各取材兩塊，分別用二種不同的組織處理方法制作切片，同批進行全自動染色機HE染色和免疫組化染色對比分析，******天選取4例，第二天12例，第三天18例，第四天32例，第五天41例，一共進行了107例HE對比染色，結果相當滿意。GS標本固定脫水套裝試劑處理的切片核漿對比分明，色彩鮮艷、結構顯示清晰，明顯優于傳統方法制片的HE染色。同時對這些病例中的26例腫瘤標本對其進行了38項抗體共176個指標的免疫組化對比染色，兩者沒有明顯的差異，部分GS組織標本固定脫水套裝試劑處理的切片免疫組化結果陽性細胞表達顯著、定位準確、背景也更清晰。我們有位病理醫師形象地把常規脫水處理的染色切片比作為標清彩電圖像，把GS組織標本固定脫水套裝試劑處理的染色切片比作高清彩電圖像，平時看習慣了標清彩電圖像總感到不錯，但看過高清彩電圖像后才發現差距這么大。

經過107例標本二種不同脫水方法的對比染色比較，堅定了我們將GS組織標本固定脫水套裝試劑大批量應用于常規標本進行組織處理的信心。在24周中每天我們將102個組織塊用環保試劑制作蠟塊，考慮到這些標本都是上午取材的，取好后又在10%中******爾馬林中固定6h以上，我們將脫水機的第二缸組織固定增減少了1h，將二缸究酒精各增加10min，將組織脫水劑Ⅰ、組織脫水劑Ⅱ各增加了30min，這樣確保組織脫水徹底，更利于組織透明劑的滲入，組織浸蠟也更充分，******次脫水機裝缸時需要雙份試劑，每缸放入4L，大約可以處理3500只組織塊，第二次更換時只需要將后一缸前移，更新一份試劑就行。在每天使用結束排蠟后，應盡量擦去剩余蠟，如殘余蠟較多，工作缸清洗液容易出現白色沉淀，可在去除沉淀后加入適量新液體，這樣能延長工作缸清洗液的使用次數。

經過1周時間107例標本二種不同脫水方法的組織切片HE染色和免疫組化染色比較，近半年時間的大批量應用GS組織標本固定脫水套裝試劑進行了常規標本組織處理，我們體會到用其制片所做的HE染色和免疫組化染色都取得了滿意的結果，能完全滿足臨床病理診斷的需要，該套環保試劑可以替代傳統的酒精脫水、二甲苯透明的石蠟制片技術，可以減少或替代甲醛和二甲苯毒害試劑的應用，降低室內有毒有害氣體的污染和毒害，從而杜絕排放此類毒化物對生活環境的污染。GS組織標本固定脫水套裝試劑不僅體現了健康、環保的理念，同時也具有優質、******性能，值得在常規病理制片過程中推廣應用。