自制組織芯片測試GS試劑對組織抗原的保存效果

孫廷誼  謝紅建  孔令非

河南省人民醫院病理科

摘自：2013年第06期《診斷病理學雜志》

我們自制組織芯片，通過免疫組化染色，對乳腺疾病組織中vimentin的表達情況進行了回顧性檢測，用來測試GS試劑對組織抗原的保存情況，取得較為滿意的效果。

1.材料和方法

 1.1材料

選取河南省人民醫院病理科2011年7月至12 月資料齊全的乳腺疾病存檔蠟塊80例，其中乳腺纖維瘤20 例，乳腺癌60例；患者術前未進行放療或化療。所選取的蠟 塊當時均是經GS無醛固定液固定、GS系列脫水透明套液試 劑制作而成。主要儀器和試劑 Leica染封一體機，Leica- Band全自動免疫組化染色儀，GS系列試劑（哈爾濱格林標 本技術開發有限公司），vimentin(即用型）和Maxvision試劑 盒均購置于福州邁新生物技術公司，Leica機用Bond Polymer Refine Detection 染色試劑盒。

 1.2 方法

  1.2.1 組織芯片制作

用自制的取樣針（內徑為1.0 mm) 在蠟塊上均勻地打出直徑稍大于1.0 mm、間距為1.0 mm的小孔，深約2 ~3 mm，制成TMA受體蠟塊。在供體蠟塊上鉆取一小圓柱形組織條，再將其送入受體蠟塊的預留孔內，按—定規則排列方陣，如此反復就制成組織芯片蠟塊。將構建 好的TMA芯片蠟塊用大載玻片輕輕蓋好，翻轉芯片蠟塊放入病理組織漂烘儀的烘片箱內，37℃，1 h，使其蠟與新插入的小圓柱狀組織溶為一體，即制成含80個位點的組織芯片，于4 ℃：冰箱中保存備用。切片時組織芯片冷凍15 min以上，切片厚3 μm，65 ℃烤片，HEJHC切片烤15 min。

  1.2.2 傳統HE染色

①切片經二甲苯I、II脫蠟各5 min； ②無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇各2 min，自來水洗；③蘇木 精染8 min，自來水洗；④1%鹽酸乙醇分化數秒鐘，自來水洗；⑤PBS返藍1 min，自來水洗；⑥1%水溶性伊紅染1 min； ⑦70%乙醇、95%乙醇各10 s，無水乙醇I、II處理各2 min，二甲苯I、II各2 min，中性樹膠封片。

  1.2.3 GS環保型染液HE染色

①切片經脫蠟液I處理5 min，脫蠟液I處理5 min，自來水洗2 min；②蘇木精染色液 處理3 ~5 min，自來水洗10 s；③分化液2 ~3 s，自來水洗1 min；④藍化液1 min，自來水洗1 min；⑤伊紅染色液處理1 ~3 min，自來水洗3 s；⑥除浮染液3 s，瀝干殘余試劑；⑦除水透明液處理1 min，瀝干；⑧透明液3 min，無苯封片膠封片。

  1.2.4 IHC手工染色

組織芯片的vimentin IHC染色：切片脫蠟至水；3% H2O2室溫處理10 min；蒸餾水洗，PBS洗2 X 3 min；采用高溫高壓組織抗原修復方法，枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6. 0)修復抗原2 min；蒸溜水洗，PBS洗2 X 3 min，滴加一抗工作液，室溫1 h；PBS洗2 X3 min；滴加Maxvision二抗，室溫15 min；PBS 洗 2 X3 min；PBS 洗 3 X3 min；DAB 顯色；蘇木精 復染；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。選用已知陽性的切片作陽性對照，以PBS替代******抗體作陰性對照。

  1.2.5 全自動IHC染色

嚴格按Leica-Band全自動免疫組化染色儀SOP文件操作。

2.結果

 2.1 組織芯片的HE染色

自制的組織芯片各點陣排列整齊，薄厚均勻，無移位、脫失現象。HE染色效果良好，細胞形態完整，組織結構顯示清晰，色彩鮮艷，核質對比分明，染色結果相比二者無明顯差異。

 2.2 組織芯片的IHC染色

自制的組織芯片經手工和 Leica Bond Max兩種免疫組化染色后各點陣排列整齊、薄厚均勻，無移位、脫失現象。vimentin胞質著色，定位準確，背景清晰，兩種免疫組化結果未見明顯差異。

3.討論

vimentin在免疫組化染色中作為對照的目的是觀察組織經甲醛固定后預期抗原表達的敏感性，按固定后抗原損傷的程度來進行分析。vimentin幾乎在任何組織中都陽性，在與上皮組織相連接的間質中存在著大量的血管vimentin陽性，如果在同一張切片的間質中出現vimentin染色微弱或部分區域變弱的情況，表明是處理的不當導致抗原破壞，所以在IHC實驗中常加入vimentin染色，用于指導觀察組織固定后抗原表達敏感性情況。本實驗vimentin胞質著色，定位準確、背景清晰，免疫組化染色結果可靠，證明標本組織的細胞抗原性保存良好。

GS試劑不含甲醛、二甲苯等有毒有害物質，運用界面化學及電荷占位原理，對組織標本進行脫水、透明和浸蠟。GS 試劑有較強的固定、脫水、脫脂兼硬化作用，不易導致組織過度收縮，無細胞空泡與核固縮現象產生，處理的組織軟硬適中，尤其對脂肪、淋巴組織等組織的處理效果較好，處理較堅韌的子宮肌瘤、皮膚組織也能使其具有較好的柔韌度而有利 于切片。GS試劑對組織滲透性強，能縮短脫水時間，能保持 良好的組織形態學結構，同時能保護細胞膜的完整性，能******限度地保護組織中的抗原和核酸不被破壞、降解或擴散，對DNA和RNA保存較佳，也有利于顯示細胞的亞結構。 通過實驗，我們體會到用GS無醛固定液固定、GS系列脫水透明套液試劑制作的組織蠟塊，經過較長時間放置后切片所做的手工和全自動染色的HE及IHC染色均能取得滿意的 結果。