比較GS環保試劑與常規試劑制備的組織樣本在熒光定量PCR中的效果

比較GS環保試劑與常規試劑制備的組織樣本

在熒光定量PCR中的效果

                                                   

張進華 肖莎  李顯箏  齊魯

南方醫科大學病理學系  廣州市珠江醫院病理科

 

摘自：2011年04期《診斷病理學雜志》

 

應用GS生物組織標本制備液（GS液）制作的石蠟切片提取DNA，進行實時熒光定量PCR技術擴增，并與常規方法制作的石蠟切片進行比較，結果沒有大的差別。證實GS液能較好地保存組織中的DNA。

1．材料與方法

1.1材料 取乳腺癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌和淋巴瘤組織各12塊，每種組織中6塊放入4%中性甲醛，6塊放入GS液，分別固定1、3、7、15、30和60天；用常規方法方法制成8μm厚石蠟切片。GS液包括環保型無醛固定液和脫水、透明、浸蠟液，由哈爾濱格林標本技術開發有限公司生產。

1.2方法

1.2.1 DNA提取  對分別固定1天和60天的5種組織按下列方法提取：①每種組織切片5張，分別裝在2ml Ep管中加入1ml二甲苯，振蕩混勻10s，室溫全速離心2min，棄上清；加入1ml無水乙醇充分混勻，室溫全速離心2min，棄上清；打開Ep管蓋，37℃孵育10min，或至殘余乙醇全部揮發。②加入500μI TET溶液和30μI蛋白K，37℃水溶過夜。③加入500μI Tris飽和酚，充分振蕩，4℃ 13000r/min離心10min，取上清，加入250μI Tris飽和酚，250μI氯仿/異戊醇（24：1），輕輕翻轉10min，4℃13000r/min離心10min，取上清，并加入1ml預冷的無水乙醇及3moI/L，NaAc 30μI,充分混勻，-20℃過夜；4℃13000r/min離心15min，棄上清。向Ep管中加入75%乙醇1ml，輕輕翻轉3min，4℃13000r/min離心15min，棄上清；室溫干燥20min，加入50μI TE緩沖液溶解DNA（-20℃保存），取DNA測量OD值。計算OD260/OD280比值的DNA含量。

1.2.2 PCR反應  用7700型實時熒光定量PCR儀擴增。向PCR反應管中依次加入GS液與4%甲醛處理的5種組織提取的DNA模板100ng（約為105拷貝DNA）10μI建立如下反應體系：Platinum SRBY  Green  qPCR SuperMix-UDG  25μI;正向引物10μMIμI；反向引物10μΜm1μI；不同模板選擇熒光素不同1μI/0.1μI；模板基因組DNA≤10μI；DEPC水補至50μI。PCR儀標準循環程序；50℃2min，40個循環；95℃15s，60℃30s。

2．結果

標記有SYBR熒光素與模板乳腺癌基因組DNA混合，標記有vic熒光素與模板結腸癌基因組DNA混合，標記有NED熒光素與模板肺癌基因組DNA混合，標記有ROX熒光素與模板卵巢癌基因組DNA混合，標記有CY5熒光素與模板淋巴瘤基因組DNA混合。完成高溫變性，低溫復性，適溫延伸的熱循環，并遵守聚合酶鏈反應規律，與模板乳腺癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌和淋巴瘤互補配對的探針被切斷，熒光素游離于反應體系中，在熒光激發波長470nm，熒光發射波長530nm，640nm、710nm、570nm、605nm定光激發下發出熒光，隨著循環到20循環，被擴增的乳腺癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌和淋巴瘤基因DNA片段呈指數規律增長，通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化的熒光信號強度轉化成線性圖譜（圖1，2）。

3．討論

本文主要探討用GS液固定1、3、7、15、30和60天的組織標本中DNA的保存情況。若固定60天的標本中能擴增出DNA，固定3、7、15和30天的組織標本也應該能擴增出DNA，所以3、7、15和30天沒有重復的意義，實驗僅取1天和60天比較。實驗結果顯示，GS液中的固定、脫水、透明試劑在病理組織標本制作中，不但能增加對組織的軟化作用，而且滲透性強于甲醛，對組織固定的同時具有脫水、脫脂的兼容性。GS液PH值在6.5-7.0，微偏酸時對保存DNA效果良好。從實驗結果看，GS液固定與4%甲醛固定，制片沒有多大差異，完全可以滿足某些腫瘤分子生物學研究。該系列試劑對工作環境污染少，******了甲醛和二甲苯對人體的毒害作用，是值得大力推廣的新型環保試劑。

圖1  4%中性甲醛固定60天的乳腺癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌和淋巴瘤的線性圖譜（從左向右），其基線期、指數增長期、線性增長期和科臺期理論擴增成立。說明4%中性甲醛固定60天后仍能較好的保存模板基因  圖2 GS液固定60天的5種標本，也能較了地保存模板基因，與4%中性甲醛固定60天的標本大致相同。
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