中性甲醛和無醛固定液短中期固定組織應用GS脫水透明系列試劑組織處理的效果比較評價

中性甲醛和無醛固定液短中期固定組織應用GS脫水透明系列試劑組織處理的效果比較評價

        何金  朱維健  徐毅

       上海市長征醫(yī)院病理科   

摘自：2011年《全國西安病理技術學術會議暨全軍病理技術學術會議》

采用甲醛固定、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋和切片、蘇木精-伊紅染色的常規(guī)病理技術自創(chuàng)建以來已有一百多年的歷史，至今仍在臨床病人和醫(yī)學研究中廣泛應用。為了社會的可持續(xù)發(fā)展，人們也更加認識到環(huán)保的重要性，對健康和環(huán)境也有了更高的要求。減少或完全替代甲醛和二甲苯毒害試劑的應用，建立一套替代技術取代石蠟包埋切片中毒害試劑的使用是一項意義重大的工作，哈爾濱格林標本技術開發(fā)有限公司經(jīng)過長時間的研究探索，終于開發(fā)出了******首創(chuàng)的全新病理技術平臺—組織固定脫水系列套裝試劑，它是國內(nèi)******個專業(yè)廠家推出的******套環(huán)保型套裝系列試劑。我們應用GS無醛固定液和10%中性甲醛同時進行短中期固定新鮮腫瘤組織，采用GS脫水透明系列試劑組織處理，然后進行常規(guī)HE染色、免疫組化染色和熒光原位雜交檢測，將此結果與臨床病理傳統(tǒng)方法的染色進行綜合效果評價。

1. 材料和方法

 1.1 材料

    選擇診斷明確的手術切除新鮮標本，乳腺癌4例、肺癌3例、結腸癌2例、、卵巢癌2例。　每例分成12塊不小于5mm×5mm×3mm的實質性腫瘤組織，分別裝入10%中性甲醛和無醛型固定液中固定，分別于固定后1天（指24小時）、 3天、 7天、15天、30天、60天取出一塊組織，放入GS格林組織固定脫水套裝試劑的全自動組織處理機進行脫水透明浸蠟，常規(guī)包埋蠟塊，待全部標本制備完成后，統(tǒng)一切片并同時進行常規(guī)HE染色、免疫組化染色和熒光原位雜交檢測。

 1.2 試劑

GS無醛生物組織樣本固定液、GS生物組織樣本制備套液、GS生物組織樣本切片染色套液有黑龍江省哈爾濱市格林標本技術開發(fā)有限公司提供。免疫組化試劑ER、PR、C-erb-B2、p53、EGFR、ki67、CA-125和即用型快捷免疫組化MaxVision^TM2試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。HER-2、EGFR基因擴增檢測試劑盒購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司。

 1.3 方法

  1.3.1臨床病理傳統(tǒng)酒精脫水、二甲苯透明、常規(guī)浸蠟包埋切片和全自動HE染色

組織經(jīng)常規(guī)10%中******爾馬林固定，取材后將組織塊放入SHANDON全自動組織處理機，常規(guī)處理程序如下，(1) 95%酒精 0:30； (2) 95%酒精  0:30；（3）95%酒精 0:30； (4) 純酒精 1:00；(5)純酒精1:00；(6)純酒精  1:00；(7)純酒精1:30；(8)純酒精 2:00；(9)二甲苯 0:30；（10）二甲苯 0:30；（11）蠟A  0:30；（12）蠟B  0:30；(13)蠟C  0:30；(14)蠟D  1:30 。常規(guī)石蠟包埋，切片厚4微米。全自動HE染色方法  所有石蠟切片常規(guī)烤片后均用Leica AUTO STAINER XL進行全自動HE染色，染色程序如下：（1） 烘烤玻片 2:00min ；(2) 脫蠟二甲苯Ⅰ 5:00 min； (3)脫蠟二甲苯Ⅱ   5:00 min；(4) 脫蠟二甲苯Ⅲ 3:00 min； (5)純酒精0:30 min； (6)95%酒精Ⅰ 0:30 min；(7)95%酒精Ⅱ0:20 min；(8)70%酒精 0:20 min；(9)流水沖洗 1:30 min；（10）蘇木精 4:00 min；（11）流水沖洗 0:45 min；（12） 1%鹽酸酒精 0:02 min；（13）流水沖洗 0:45 min；   （14）溫水藍化 0:30 min；（15）伊紅染色 0:03 min；（16）純酒精Ⅰ 0:20 min；（17）純酒精Ⅱ0:20 min；（18）純酒精Ⅲ 0:20 min；（19）純酒精Ⅳ  0:20 min；（20）石炭酸二甲苯 0:45 min；  （21）二甲苯Ⅰ0:20 min；（22） 二甲苯Ⅱ 0:20 min；（23）二甲苯Ⅲ 0:20 min；（24）退出。取出切片后常規(guī)中性樹膠封片。

  1.3.2   GS格林組織固定脫水套裝試劑制片法 

新鮮腫瘤組織放入10%中性甲醛和無醛型固定液，分別于固定后1天（指24小時）、 3天、 7天、15天、30天、60天取出一塊組織，將組織塊放入裝有GS格林組織固定脫水套裝試劑的另一臺SHANDON全自動組織處理機，組織處理程序如下：（1） 組織固定劑  1:00；（2）組織固定劑 2:00；（3）95%酒精 0:15；（4）純酒精 0:15；（5）組織脫水劑Ⅰ 0:40；（6） 組織脫水劑Ⅰ 1:20；（7）組織脫水劑Ⅱ 0:40；(8) 組織脫水劑Ⅱ 1:20; (9) 組織透明劑1:00；(10) 組織透明劑 1:30；（11） 浸蠟Ⅰ0:45；(12) 浸蠟Ⅰ  0:50；(13) 浸蠟Ⅱ 0:50；(14) 浸蠟Ⅱ 1:00 。常規(guī)石蠟包埋后收集蠟塊，待全部標本制備完成后，統(tǒng)一切片并同時進行GS病理切片HE染色、免疫組化染色和熒光原位雜交檢測。

  1.3.3   GS病理切片全自動HE染色 

將收集的蠟塊統(tǒng)一切片后常規(guī)烤片，將GS染色系列套裝試劑放入Leica AUTO STAINER XL同時進行GS病理切片全自動HE染色，其染色程序如下：（1） 烘烤玻片 2:00min；(2) 脫蠟Ⅰ（GSA-07） 5:00 min ；(3) 脫蠟Ⅰ（GSA-07）5:00 min ；(4) 脫蠟Ⅰ（GSA-07） 5:00 min；(5)抖動0:10 min；  (6) 脫蠟Ⅱ（GSA-08） 2:00 min；(7) 脫蠟Ⅱ（GSA-08）2:00 min；(8) 脫蠟Ⅱ（GSA-08） 2:00 min；  (9)流水沖洗 2:00 min；（10）蘇木素染色液（GSA-09） 4:00 min；（11）流水沖洗 0:45 min；（12） 1%鹽酸酒精 0:02 min；（13）流水沖洗 2:00 min； （14）溫水藍化 0:30 min；（15）伊紅(GS-10) 染色 1:00 min；（16）流水沖洗 0:05min；（17）除浮染液（GSA-11）0:03min；（18）瀝干 2:00min；（19）除水透明液Ⅰ（GSA-11）1:00min；（20）除水透明液Ⅰ（GSA-11）1:00min；（21）除水透明液Ⅰ（GSA-11）1:00min；（22）瀝干 2:00min；（23）切片透明液（GSA-13）1:00 min；（24）切片透明液（GSA-13）2:00min；（25）退出。取出切片后常規(guī)中性樹膠封片。

  1.3.4  自動免疫組化染色機染色

為了使兩種固定方法的組織的免疫組化染色更具有可比性，必須盡量減少外在因素的干擾，我們統(tǒng)一將所有標本采用LabVision Antostainer 720自動免疫組化染色機染色。為了便于染色后對切片進行觀察分析，我們將同一例用兩種固定液固定同一時間的組織在切片時就撈在同一張玻片上，一同進行免疫組化染色。4例乳腺癌組織檢測ER、 PR、C-erb-B2；2例結腸癌檢測CA-19-9、 p53 ；3例肺癌檢測 EGFR、ki67；2例卵巢癌檢測CA-125。具體染色方法如下：（1）石蠟切片4微米，常規(guī)烤片后GSA-07脫蠟Ⅰ5min×3；(2)GSA-08脫蠟Ⅱ2min；（3）蒸餾水洗；（4）pH6.0檸檬酸鹽緩沖液高壓鍋修復抗原1.5min；（5）蒸餾水洗后將切片放入染色機內(nèi)進行自動化加樣染色，（6）3%過氧化氫10min，PBS洗；（7）分別加上述******抗體孵育60min，PBS洗；（8）新型快捷型酶標鼠/兔聚合物15min，（9）DAB顯色5min；（10）蘇木素復染2min，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。

  1.3.5  FISH檢測

采用熒光原位雜交直接法，選用北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司的HER-2、EGFR基因擴增檢測試劑盒，對2例乳腺癌的R-A1(1) 、R-B1(1) 、R-A1(60) 、R-B1(60)、R-A4(30)、R-B4(30)  和1例肺癌的F-A3(7)、F-B3(7)    進行FISH檢測，操作步驟嚴格按照說明書進行。結果判斷：浸潤性乳腺癌細胞核內(nèi)橘紅色HER-2基因熒光信號與17號染色體綠色熒光信號比值＞2.2時為HER-2基因擴增，＜1.8為無擴增，若比值在1.8～2.2之間，則需要再計數(shù)30個細胞核中的信號。肺癌EGFR基因擴增主要有三種情況，腫瘤細胞內(nèi)出現(xiàn)成簇的橘紅色擴增信號；橘紅色信號與綠色信號比值≥2；EGFR/CSP7比值小于2，但大于或等于4個紅色信號（EGFR信號）細胞數(shù)占所分析細胞總數(shù)的40%以上。

2.  結果

   2.1 HE染色 

A組片用中性甲醛固定、GS生物組織樣本制備套液、GS生物組織樣本HE切片染色套液制備的HE切片比臨床病理傳統(tǒng)方法制備的切片染色效果好，細胞核與細胞質染色對比鮮明、結構更清晰。B組片用GS無醛固定液和GS組合試劑制作的切片的染色效果與中性甲醛固定、GS組合試劑制作的切片的染色效果相當，只是組織有些收縮，細胞間隙較明顯。（圖1 ~12） 

圖1  B1104870 乳腺癌傳統(tǒng)方法制片HE×20 

圖4  B1109183肺肉瘤樣癌  傳統(tǒng)方法制片HE×20

圖10  B1109801卵巢癌傳統(tǒng)方法制片HE×20

 

2.2 免疫組化染色結果 

A組片中性甲醛固定、GS生物組織樣本制備套液制備的切片所做的各項免疫組化染色要比臨床病理傳統(tǒng)方法制備的切片免疫組化染色效果好，特別是ER和PR表達的著色強度、陽性細胞數(shù)都要比傳統(tǒng)方法制片的免疫組化染色著色深、陽性細胞數(shù)多，而B組片的免疫組化染色除ER和PR要比A組片弱一些外，其它指標均相差不大。二種固定液短中期固定組織的免疫組化染色無明顯差異。（圖15 ~30）

A、B組切片與傳統(tǒng)方法制片的免疫組化染色比較
分類	編號	病理號	傳統(tǒng)方法制片		A組片		B組片
			陽性細胞數(shù)	著色強度	陽性 細胞數(shù)	著色強度	陽性 細胞數(shù)	著色強度
乳腺癌ER	R1	1104870	20%	++	50%	++	20%	+
	R2	1105356	50%	++	90%	+++	70%	++
	R3	1107963		—		—		—
	R4	1109804	30%	+	70%	++	30%	+
乳腺癌PR	R1	1104870	10%	+	30%	+++	5%	+
	R2	1105356	70%	++	90%	+++	50%	++
	R3	1107963		—		—		—
	R4	1109804	50%	++	70%	++	30%	+
乳腺癌C-erbB2	R1	1104870	90%	+++	90%	+++	90%	+++
	R2	1105356	50%	++	70%	++	50%	++
	R3	1107963	70%	+++	70%	+++	70%	+++
	R4	1109804	100%	+++	100%	+++	100%	+++
肺癌EGFR	F1	1105137		—		—		—
	F2	1105455		—		—		—
	F3	1109183		±		±		±
肺癌Ki-67	F1	1105137	30%	+	30%	+	30%	+
	F2	1105455	25%	+	25%	+	25%	+
	F3	1109183	25%	++	40%	+++	40%	++
結腸癌CA19-9	J1	1105136	20%	+	20%	+	20%	+
	J2	1105470	30%	+	30%	+	50%	+
結腸癌P53	J1	1105136		—		—		—
	J2	1105470	40%	+	40%	++	40%	++
卵巢癌CA125	L1	1109524		—		—		—
	L2	1109801		—	20%	++	35%	++

2.3  FISH檢測結果  

    2例傳統(tǒng)方法制片的乳腺癌和R-A1(1) 、R-B1(1) 、R-A1(60) 、R-B1(60)、R-A4(30)、R-B4(30)的HER-2基因 FISH檢測結果均見有呈簇狀分布的紅色信號， 對1例肺癌和F-A3(7)、F-B3(7) 的EGFR基因進行FISH檢測，也均見有呈簇狀分布的紅色信號。中性甲醛和無醛固定液短中期固定組織后用GS脫水透明系列試劑組織處理的切片進行FISH檢測都能得到滿意的結果。（圖31~41）

3.討論

進入21世紀的今天，人類的進步和城市的發(fā)展已到了一個新的高度，人們對健康和環(huán)境也有了更高的要求，為了社會的可持續(xù)發(fā)展，也更加認識到環(huán)保的重要性。減少或完全替代甲醛和二甲苯毒害試劑的應用，建立一套替代技術取代石蠟包埋切片中毒害試劑的使用是一項意義重大的工作，它不僅是我們每個病理工作者的追求的愿望，也是我們對社會應盡的義務。去年初我們剛開始試用格林組織固定脫水套裝試劑時，首先做了107標本二種不同脫水方法的HE染色比較，結果發(fā)現(xiàn)同一例標本采用二種不同脫水方法的組織塊在包埋時就感覺到不一樣，常規(guī)脫水、透明的組織塊脆硬，包埋時易碎裂；格林組織固定脫水套裝試劑處理的組織塊軟硬適中便于包埋。在切片時不論組織大小環(huán)保試劑處理的組織塊也更好切，特別是肌瘤、皮膚和骨組織等堅硬的組織塊比常規(guī)脫水的組織塊更容易切片。同一例標本二種不同脫水方法的切片同一染色架進行HE染色，格林組織固定脫水套裝試劑處理的切片組織紅藍適度、核漿對比分明，色彩鮮艷、結構顯示清晰，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法制片的HE染色。這次我們選擇乳腺癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌共11個病例，進行A組用中性甲醛、B組用無醛固定液短中期固定組織應用GS脫水透明系列試劑組織處理的效果比較評價，每組固定第1、3、7、15、30、60天后，兩組一起用GS生物組織樣本制備套液制備切片后，再用GS生物組織樣本HE切片染色套液進行染色，固定不同時間HE染色均能得到滿意的結果，A、B組的HE形態(tài)要明顯好于該病例用傳統(tǒng)方法制備的切片。

11例臨床常見的乳腺癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌標本，每個病例分為A、B二組分別用中性甲醛和GS無醛固定液進行短、中期固定效果比較，共132個組織蠟塊，用ER、 PR、C-erb-B2、 CA-19-9、 p53 、 EGFR、ki67、 CA-125分別做了264個標記的免疫組化染色，并與臨床傳統(tǒng)方法制片的免疫組化染色進行對比分析。我們發(fā)現(xiàn)用中性甲醛固定、GS生物組織樣本制備套液制備的切片所做的各個指標的免疫組化染色結果要明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法制片做到免疫組化染色；GS無醛固定、GS格林組織固定脫水套液制備的切片所做的的免疫組化染色，除ER、PR結果比傳統(tǒng)方法制片免疫組化染色稍弱
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添加時間：2016-04-07 點擊量：1203