格林組織標本制備及切片染色套液在病理實驗室中的應用

格林組織標本制備及切片染色套液在病理實驗室中的應用

朱衛國  劉春玲  崔芳  陳怡  寇雪梅  孫海濤

武警北京總隊第二醫院病理科  中國中醫科學院廣安門醫院  哈爾濱市242醫院

摘自：2012年第07期《武警醫學》

隨著人們健康環保意識的不斷增強，醫學實驗室的環保 問題已經備受關注。病理實驗室污染主要由傳統的石蠟制片蘇木素伊紅染色方法中不可或缺的甲醛和二甲苯所造成。 為解決這一環保難題，臨床一直在尋找替代甲醛和二甲苯的新型病理試劑，但均因效果不穩定或價格高昂而未能推廣。 基于健康環保的需求，哈爾濱格林標本技術開發有限公司研發了格林組織標本制備及染色套液（以下簡稱GS套液）新型環保試劑，本研究對GS套液在我院病理科的使用及其效果進行了評估。

1. 材料與方法

材料臨床送檢的各種活體組織病理標本共40例，包括胃腸道、肺、食管、皮膚、乳腺、淋巴結、脂肪、子宮、宮頸等組織各2組份，每份標本分別取材2個組織塊，分為傳統石 蠟制片、染色方法和GS套液石蠟制片、染色方法兩組，分別進行組織處理、石蠟制片、HE染色、免疫組化染色，并對比其制片和染色效果。

 1.2試劑

GS組織標本制備套液及GS病理切片染色套液，包括無醛組織固定液，環保無苯脫水、透明、浸蠟液，脫蠟液，HE染色液，透明液及封片膠；傳統石蠟制片及染色所需試劑為病理科原有，包括10%中性甲醛固定液，梯度乙醇脫水液，二甲苯透明液，石蠟浸液，HE染液及中性樹膠封片膠。

 1.3方法

  1.3.1傳統石蠟制片及染色方法

1.3.1.1組織處理及制片常規外檢取材后，組織經常規10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟，包埋，石蠟切片3~5μm。

1.3.1.2石蠟切片染色 ⑴切片經二甲苯I、II缸脫蠟5min；⑵反梯度乙醇各2 min，自來水漂洗；⑶蘇木素染色5~8min；⑷1%鹽酸乙醇分化液，數秒，自來水漂洗；⑸1%氨水藍化液，1min，自來水漂洗；⑹0.5%水溶性伊紅染漿1min；⑺梯度乙醇脫水各2 min；⑻二甲苯I、II透明各2 min；⑼二甲苯稀釋中性樹膠封片。

  1.3.2 GS套液石蠟制片及染色方法

1.3.2. 1組織處理及制片常規外檢取材后，組織經固定液I缸固定1 h， II缸固定3 h；雙缸脫水液I脫水40min和1 h，雙缸脫水液II脫水30 min和1 h；透明液I缸1 h，透明液II缸1.5 h；浸蠟I、II缸各1. 5 h；石蠟包埋，石蠟切片3 ~5μm。

1.3.2.2石蠟切片HE染色方法（1)切片經脫蠟液I、II各5 min，自來水漂洗2 min；(2)蘇木素染液3 ~5 min；自來水漂洗10 s；(3)1%鹽酸乙醇分化液2 ~3s； (4) 1%氨水藍化液，1 min，自來水漂洗1 min；(5)伊紅染色液1 ~3 min，自來水漂洗3 s； (6)除浮染液3 s，瀝干；（7)除水透明液1 s，瀝干；（8)透明液3 min； (9)無苯封片膠封片。

1.3. 3 傳統方法和GS套液組織處理及切片染色程序對比在標本制備和切片染色處理環節相同的情況下，對比GS套液石蠟制片及染色方法較傳統方法操作步驟和染色時間上的不同之處。

1.3.4結果判定標本取材及組織處理分組專人負責，切片及染色過程由兩組負責人交換進行；常規石蠟切片和HE 染色質量標準參照《病理學技術》1 ，甲級切片判定標準：(1)切片完整，厚度4 ~6 μm，薄厚均勻，無褶無刀痕；（2)染色核漿分明，紅藍適度，透明潔凈，封裱美觀。

2. 結 果

 2.1 GS套液和傳統方法試劑理化特性優缺點對比  

組織處理方面，GS套液比傳統方法具有很大的優勢，兩種試劑的固定液、脫水液理化特性對比見表1、2。在透明液理化特性方面，GS套液透明無色、無味、******，屬I類有機溶劑，對組 織處理柔和；而二甲苯透明無色、有強烈刺激味，有毒，對組織收縮性強，易使組織變硬變脆。

 2.2組織處理和染色步驟對比與傳統方法相比

GS套液方法組織處理程序由傳統方法的13步減至6步，而HE染色程序由傳統方法的22步減至7步，更加易于操作，效果良好。處理后的組織，脫水、透明及浸蠟徹底，組織石蠟包埋緊密，尤其是皮膚、脂肪、淋巴結和肌瘤等組織處理效果優于傳 統石蠟方法。

 2.3石蠟切片效果對比

經GS套液處理后的組織石蠟，石蠟切片柔韌適中，厚薄均勻，連續性好，與傳統方法處理較好的組織蠟塊切片效果相當，對于傳統方法難切的組織效果更佳。

 2.4 HE染色效果對比

GS套液方法石蠟切片HE染色程序簡單，染色速度快，染液滲透均勻，色彩鮮亮，核漿對比清 晰，形態結構顯示清楚，與傳統HE染色方法基本相同，且效果穩定（圖1)。

表1 GS套液和傳統方法組織處理固定液理化特性對比

 

表2 GS套液和傳統方法組織處理脫水液理化特性對比

 2.5免疫組化染色效果免疫組化染色陽性率和陽性強度與傳統病理技術效果一致（圖2)。

  圖1傳統方法和GS套液方法HE染色效果對比

圖2 GS套液方法免疫組化染色

GS 套液方法：c-erbB-2( x400) ;B. GS 套液方法：MDR( x400) ;C. GS 套液方法：P53( x400) ;D. GS 套液方法：nm23( x400)

 2.6環境污染情況分析

采用GS組織標本制備套液及GS 病理切片染色套液后，基本實現了工作環境的******化。從取材、脫水、透明、浸蠟、包埋到切片、染色、封片全過程，尤其在大標本固定后取材、人工染片、中性樹膠封片及鏡下閱片時，克服了傳統方法甲醛和二甲苯所帶來的人體危害和實驗室內外環境的污染。

3. 討論

近百年來，常規甲醛固定、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟 包埋、石蠟切片和HE染色等組織病理學技術，以其穩定的效果_直為國內外病理實驗室所沿用。然而傳統組織病理學技術中有毒化學試劑的使用也同時威脅著病理工作者的健康并造成嚴重的醫源性環境污染，其中用量大、危害重的試劑以甲醛和二甲苯為突出。

甲醛的缺點主要是具有強烈的刺激性和腐蝕性，因揮發性強、防護困難而造成實驗室內外環境的污染，長期接觸會對呼吸系統、神經系統、造血系統造成損傷，甚至誘發惡性腫瘤，2004年WHO已宣布甲醛為致癌物質；組織經甲醛固定后，會引起蛋白交聯反應，對免疫組化和分子生物學研究產生影響。二甲苯作為***常用的苯類試劑大量應用于病理組織處理和染色的過程中，其毒害作用已十分肯定，主要是對************、植物神經和皮膚黏膜產生刺激作用，也是明確的致癌物質之一。如果大量含有甲醛、二甲苯、氣化汞及石蠟的實驗室廢液不經專業處理直接排入下水，會造成周邊環境的嚴重污染，但若進行專業回收處理又會大大提高成本。

隨著分子生物學的快速發展和對醫學實驗室環評標準的逐步提高，使用環保試劑、創建“綠色”實驗室已是大勢所趨，研發替代甲醛、二甲苯的病理試劑也是病理工作者多年的愿望。國內外已有使用甲醛、二甲苯替代產品的相關報道，但尚缺乏成熟和大樣本的相關技術報道。有學者嘗試在甲醛溶液中加入添加劑以減少甲醛的揮發，用脫色汽油、硬脂酸、異丙醇、松節油等替代二甲苯，雖取得一定效果，但也存在許多弊端。

本實驗采用由哈爾濱格林標本技術開發有限公司研發的新型環保GS組織標本制備及染色套液，在病理技術方面， 尤其是替代有毒試劑甲醛、二甲苯，取得了突破性成功，經我院病理實驗室應用后效果良好且穩定。

經本實驗研究證明，與傳統技術相比，GS組織標本制備 及染色套液的優勢在于：（1)在組織固定、脫水、透明、染色、封片技術中，全程替代了毒害試劑的使用，新型試劑可以自動降解，避免了對環境的醫源性污染，實現了創建綠色環保型病理實驗室的目標；（2)固定劑滲透性強，并能較好的保護 組織抗原和核酸成分；（3)脫水效果穩定，大小組織標本可以 同時處理，未出現過脫或不足的現象；（4)透明劑滲透徹底， 作用溫和，組織軟硬度適中，充分保證了切片質量，尤其對韌度較強的組織，切片質量優于傳統技術；（5)病理切片脫蠟和 染色脫水后透明處理理想，封片膠不用二甲苯稀釋；（6) GS 蘇木素染液不含氣化汞，不產生氣化膜，HE染色快速均勻， 色彩鮮明，核漿對比明顯；不需自行配制，便于實驗室質量控 制。其缺點在于與傳統方法相比，試劑價格相對偏高，更適 合于標本量較大的病理實驗室。

本實驗證明，新型環保GS組織標本制備及染色套液具 有創新性和實用性，組織處理、制片及染色效果穩定可靠，能夠滿足常規病理和免疫組織化學等需求，其實際應用效果與傳統病理技術效果相一致，具有良好的應用前景，值得病理實驗室廣泛推廣。

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添加時間：2016-04-07 點擊量：1392