GS環(huán)保試劑在病理制片技術(shù)工作中的應(yīng)用

GS環(huán)保試劑在病理制片技術(shù)工作中的應(yīng)用

      田玉旺 朱紅艷 李琳 苗金紅 朱培雙 邢宜

      北京軍區(qū)總醫(yī)院病理科

在日常病理組織制片及染色過(guò)程中，甲醛和二甲苯作為病理常規(guī)試劑被大量應(yīng)用。這些試劑具有強(qiáng)烈的刺激性和揮發(fā)性，不僅污染環(huán)境，而且嚴(yán)重危害身體健康。因此，尋找一種對(duì)人體******無(wú)害且安全的甲醛和二甲苯替代品，已成為病理技術(shù)工作者的一種迫切愿望。本文將環(huán)保型“GS組織樣本制備及染色套液”應(yīng)用于病理技術(shù)工作中，收到了理想制片效果。

 1. 材料與方法

  1.1 標(biāo)本　

臨床送檢的各種活體組織病理標(biāo)本。一組采用傳統(tǒng)石蠟制片方法；另組采用環(huán)保試劑制片方法，比較二者制片后的各種染色效果。如：HE染色、免疫組化染色及組織化學(xué)染色。

  1.2 GS環(huán)保試劑 

GS組織樣本制備套液及GS病理切片染色套液(由哈爾濱格林標(biāo)本技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司研制并生產(chǎn))。

  1.3方法

   1.3.1 傳統(tǒng)石蠟制片法  組織經(jīng)常規(guī)10%中******爾馬林固定，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，厚4-5微米。

   1.3.2 GS環(huán)保試劑制片方法  離體新鮮組織標(biāo)本經(jīng)下列步驟處理 = 1 \* GB3 ①固定液 = 1 \* ROMAN I 1h、固定液 = 2 \* ROMAN II 3h； = 2 \* GB3 ②脫水液 = 1 \* ROMAN I×2，分別為40min、1h，脫水液 = 2 \* ROMAN II ×2，分別為30min、1h； = 3 \* GB3 ③透明液 = 1 \* ROMAN I 1h，透明液 = 2 \* ROMAN II 1h30min； = 4 \* GB3 ④浸蠟液 = 1 \* ROMAN I、 = 2 \* ROMAN II各1h30min，石蠟包埋，切片，厚4-5微米。

   1.3.3 傳統(tǒng)HE染色方法   = 1 \* GB3 ①切片經(jīng)二甲苯 = 1 \* ROMAN I、 = 2 \* ROMAN II脫蠟各5min； = 2 \* GB3 ②無(wú)水酒精、95%酒精、80%酒精各2min，自來(lái)水洗； = 3 \* GB3 ③蘇木素染8min，自來(lái)水洗； = 4 \* GB3 ④1%鹽酸酒精分化數(shù)秒鐘，自來(lái)水洗； = 5 \* GB3 ⑤1%氨水返藍(lán)1min，自來(lái)水洗； = 6 \* GB3 ⑥1%水溶性伊紅染1min； = 7 \* GB3 ⑦70%酒精、95%酒精各10s，無(wú)水酒精 = 1 \* ROMAN I、 = 2 \* ROMAN II各2min，二甲苯 = 1 \* ROMAN I、 = 2 \* ROMAN II各2min，中性樹(shù)膠封片。

   1.3.4 GS環(huán)保型染液HE染色步驟   = 1 \* GB3 ①切片經(jīng)脫蠟液 = 1 \* ROMAN I 5min，脫蠟液 = 2 \* ROMAN II ５min，自來(lái)水洗2min； = 2 \* GB3 ②蘇木素染色液3～5min，自來(lái)水洗10s； = 3 \* GB3 ③分化液2～3s，自來(lái)水洗1min； = 4 \* GB3 ④藍(lán)化液1min，自來(lái)水洗1min； = 5 \* GB3 ⑤伊紅染色液1～3min，自來(lái)水洗3s； = 6 \* GB3 ⑥除浮染液3s，瀝干殘余試劑； = 7 \* GB3 ⑦除水透明液1min，瀝干； = 8 \* GB3 ⑧透明液3min，無(wú)苯封片膠封片。

   1.3.5 免疫組織化學(xué)染色  乳腺組織采用PV-6000通用二步法分別進(jìn)行P63和34βE12染色，具體染色步驟同常規(guī)。

   1.3.6 組織化學(xué)染色  胃黏膜組織進(jìn)行PAS染色，腎組織進(jìn)行PAMS染色，具體染色步驟同常規(guī)。

 2. 結(jié)果

2.1 采用GS組織樣本制備套液制作的組織蠟塊，在切片中感覺(jué)組織塊軟硬適中，切片厚薄均勻，連續(xù)性好，與傳統(tǒng)方法制備的組織蠟塊切片效果基本相同。脂肪組織、子宮肌瘤及皮膚等組織切片效果優(yōu)于傳統(tǒng)方法。采用環(huán)保型GS染色套液進(jìn)行HE染色，染液滲透力強(qiáng)，染色速度快，組織結(jié)構(gòu)顯示清晰，色彩鮮艷，核漿對(duì)比分明，與傳統(tǒng)HE染色結(jié)果相比二者無(wú)明顯差異（圖1）。

2.2 采用環(huán)保型GS組織樣本制備套液制作的乳腺組織石蠟切片，經(jīng)免疫組化P63和34βE12染色，結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)抗原成分保存良好，陽(yáng)性結(jié)果定位準(zhǔn)確，背景清晰，與傳統(tǒng)方法制片染色效果基本相同（圖2，3）。

2.3 GS組織樣本制備套液制作的石蠟切片，腎組織進(jìn)行PAMS染色，胃粘膜組織行PAS組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示，腎小球基底膜和胃組織中的中性粘液染色清晰，色澤鮮艷，陽(yáng)性物質(zhì)定位準(zhǔn)確，與傳統(tǒng)方法制片染色效果相同（圖4,5）。

 3. 討論

3.1 在組織處理過(guò)程中，組織固定至關(guān)重要，它直接影響著各種染色效果。采用甲醛固定組織的模式已延續(xù)了一百多年。它對(duì)組織滲透能力強(qiáng)，組織固定均勻，組織收縮小，盡管它具有高毒性，但由于其成本低，能較好地保存組織結(jié)構(gòu)，所以至今仍廣泛被人們所接受。甲醛主要存在以下缺點(diǎn)：①易揮發(fā)，具有較強(qiáng)烈的刺激性和腐蝕性^[1]，嚴(yán)重造成空氣和環(huán)境污染，而防護(hù)又極為困難。國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，人體皮膚直接接觸甲醛時(shí)，會(huì)引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)、皮炎或濕疹。長(zhǎng)期接觸甲醛可能會(huì)引發(fā)慢性呼吸道疾病、癌癥發(fā)生，如鼻咽癌、結(jié)腸癌、腦瘤、白血病，引起體內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量下降，導(dǎo)致記憶力和智力下降。2004年6月15日WHO正式宣布甲醛為致癌物質(zhì)，同時(shí)提醒人們要重視甲醛的致癌性，并采取預(yù)防措施。②甲醛存放過(guò)久易產(chǎn)生白色沉淀即三聚甲醛，而影響組織標(biāo)本固定效果；③甲醛容易氧化變成甲酸，使溶液變?yōu)樗嵝裕瑢?dǎo)致標(biāo)本酸化，嚴(yán)重時(shí)影響細(xì)胞核的染色效果；使用甲醛固定的陳舊組織，以多血的臟器如脾和肝等，組織內(nèi)易形成甲醛色素，易與含鐵血黃素相混淆，使病理診斷受到嚴(yán)重影響；④不能固定肝糖原和尿酸；⑤廢液需特殊處理，不能直接排入管道。廢液處理費(fèi)較高，每千克30～40元。 = 6 \* GB3 ⑥目前采用的以醛類為基礎(chǔ)的固定液（如甲醛）處理標(biāo)本，可引起組織內(nèi)廣泛的蛋白質(zhì)交聯(lián)，組織切片進(jìn)行免疫組化染色時(shí)因蛋白質(zhì)交聯(lián)需進(jìn)行抗原修復(fù)。研究顯示，無(wú)交聯(lián)作用的醇類固定劑在保存DNA方面比醛類固定劑效果更好。若單純用純酒精固定液或乙醇類固定液，易導(dǎo)致核固縮、細(xì)胞空泡出現(xiàn)，組織皺縮，組織變硬變脆等缺陷。理想固定液應(yīng)該是：毒性低，HE、免疫組織化學(xué)及組織化學(xué)等染色均可達(dá)到******效果，同時(shí)還有利于DNA/RNA生物大分子的修復(fù)，以便進(jìn)行分子生物學(xué)研究。

3.2 近年來(lái)，隨著對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境安全更高的要求以及分子生物學(xué)飛速發(fā)展的需求，研發(fā)和生產(chǎn)理想的沒(méi)有毒性的甲醛替代固定劑已成大勢(shì)所趨刻不容緩。雖然國(guó)外已有使用甲醛、苯類等綠色替代產(chǎn)品進(jìn)行病理制片的相關(guān)報(bào)道^[2-4]，但國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道較少。本文采用的國(guó)產(chǎn)GS固定液為環(huán)保型無(wú)醛復(fù)合固定液，它是固定技術(shù)的新突破，是病理工作者的福音，它將使建立綠色病理實(shí)驗(yàn)室夢(mèng)想成真。它的特點(diǎn)是無(wú)色、無(wú)刺激性，低揮發(fā)性，不含甲醛等任何醛類化合物，綠色環(huán)保，易生物降解，使用后不會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生危害。經(jīng)大量實(shí)際應(yīng)用，GS固定液與傳統(tǒng)甲醛固定液處理的組織制片效果基本相同，它完全可以取代甲醛對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行固定。它的主要特點(diǎn) = 1 \* GB3 ①對(duì)組織滲透性強(qiáng)，能縮短脫水時(shí)間。 = 2 \* GB3 ②能保持良好的組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，同時(shí)能保護(hù)細(xì)胞膜的完整性。 = 3 \* GB3 ③有較強(qiáng)的固定、脫水、脫脂兼硬化作用，不易導(dǎo)致組織過(guò)度收縮，無(wú)細(xì)胞空泡與核固縮現(xiàn)象產(chǎn)生。 = 4 \* GB3 ④經(jīng)GS固定液保存的大體標(biāo)本，取材時(shí)觸之感覺(jué)良好，易于分離并切取較薄的具有代表性的組織塊。可去除脂肪組織標(biāo)本的粘滑感及粘稠性，使清潔工作快速及簡(jiǎn)單。尤其對(duì)脂肪含量較豐富的組織處理效果更佳。 = 5 \* GB3 ⑤能******限度地保護(hù)組織中的抗原和核酸不被破壞、降解或擴(kuò)散。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：陽(yáng)性率和陽(yáng)性強(qiáng)度與傳統(tǒng)制片法效果一致。 = 6 \* GB3 ⑥對(duì)DNA和RNA保存較佳，有利于顯示細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)，對(duì)組織標(biāo)本的分子生物學(xué)研究較好，根除了在分子生物學(xué)研究中必須使用新鮮組織的必要性。 = 7 \* GB3 ⑦GS固定液回收簡(jiǎn)便易行，不需甲醛中和劑進(jìn)行處理廢液，可依據(jù)乙醇廢液處理管理?xiàng)l例處置廢液。

3.3 GS脫水液的脫水效果好，不會(huì)產(chǎn)生組織脫水過(guò)度或脫水不夠現(xiàn)象，不易造成組織過(guò)度硬化，大小組織可同時(shí)進(jìn)行處理，處理的組織軟硬適中，尤其對(duì)脂肪、淋巴組織及較堅(jiān)韌的子宮肌瘤等組織的處理較傳統(tǒng)方法制片效果好。

3.4 傳統(tǒng)組織處理和染色過(guò)程中，二甲苯被病理實(shí)驗(yàn)室大量使用，它極易揮發(fā)，是一種對(duì)人體具有較強(qiáng)毒害作用的有機(jī)化學(xué)試劑。其毒性主要是對(duì)************和植物神經(jīng)的麻醉及粘膜的刺激作用，長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致頭暈、******、肢體震顫、*********下降等，是致癌物質(zhì)之一^[5]。除對(duì)病理工作者的健康構(gòu)成威脅外，有的單位還將廢棄的二甲苯大量的傾倒進(jìn)下水道也造成了更大范圍的城市水系環(huán)境污染。在組織處理過(guò)程中，若在二甲苯中浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，易產(chǎn)生組織收縮和硬化現(xiàn)象，常使含纖維豐富的組織如子宮肌瘤等組織變得堅(jiān)硬難切，使含膠質(zhì)較多的組織變脆后切成條狀，使含脂肪較多的組織脫脂不凈影響組織浸蠟，導(dǎo)致制片質(zhì)量下降。

3.5 為了克服二甲苯存在的缺點(diǎn)，有的學(xué)者嘗試用脫色汽油^[6]、硬脂酸^[7,8]、異丙醇^[9]、松節(jié)油等替代二甲苯，雖取得一定效果，但還是存在許多弊端。我們?cè)诮M織處理和染色中采用了GS環(huán)保型脫蠟劑、透明劑和封片劑，收到了理想制片效果。這些試劑均為非苯類******型復(fù)合試劑，可以替代二甲苯對(duì)組織切片進(jìn)行脫蠟和染色脫水后的透明處理以及封片，徹底根除了二甲苯對(duì)人體的傷害及其對(duì)環(huán)境的污染。GS脫蠟劑，使組織切片脫蠟徹底，速度快。GS透明劑對(duì)組織滲透力強(qiáng)，處理組織軟硬適中，對(duì)組織處理較溫和，組織標(biāo)本即使較長(zhǎng)時(shí)間浸泡在其中也不會(huì)出現(xiàn)明顯的收縮和硬化現(xiàn)象，不易使組織變硬變脆，特別是對(duì)子宮肌瘤、皮膚等較韌的含纖維較多的組織柔韌度較好，切片質(zhì)量好于傳統(tǒng)制片法。

3.6 HE染色過(guò)程中使用的GS蘇木素染色液為無(wú)汞染液，對(duì)人無(wú)危害，對(duì)組織親和力強(qiáng)，染色速度快，不易產(chǎn)生氧化膜而污染組織，切片長(zhǎng)期存放細(xì)胞核不易褪色，染液使用時(shí)間長(zhǎng)。鏡下組織切片色彩鮮艷，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，核漿對(duì)比分明，與傳統(tǒng)HE染色效果一致。

3.7 取材后的組織樣本體積在1.5cm×1.5cm×0.3cm范圍較好。手術(shù)大標(biāo)本，建議切開(kāi)后固定，固定劑的量應(yīng)為標(biāo)本體積的4～5倍。

針對(duì)甲醛和二甲苯的高毒性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了多年研究，如在甲醛溶液中加入添加劑以減少甲醛的揮發(fā)，但效果仍不理想，即使加強(qiáng)通風(fēng)，并不能完全******其危害。我們使用GS環(huán)保試劑替代甲醛及苯類試劑后，從源頭上杜絕了有害試劑對(duì)室內(nèi)外環(huán)境的污染。GS環(huán)保試劑的問(wèn)世，為建立“綠色實(shí)驗(yàn)室”奠定了良好基礎(chǔ)，未來(lái)的病理實(shí)驗(yàn)室將逐步成為環(huán)保型的實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)大量實(shí)際應(yīng)用證實(shí)，環(huán)保型GS組織樣本制備套液和染色液，完全適用于病理診斷所需的常規(guī)HE染色、免疫組化染色及組織化學(xué)染色等，其各種染色效果與傳統(tǒng)方法制作的切片染色效果相同，值得同行廣泛應(yīng)用。

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圖3乳腺腺病：腺上皮細(xì)胞胞漿34βE12(+)。PV-6000法×200  

圖4 腎組織：腎小球基底膜呈黑色。PAMS×400

圖5 胃黏膜組織：中性黏液呈紅色。PAS×400

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