GS環保型試劑在病理技術工作中的應用體會

GS環保型試劑在病理技術工作中的應用體會

易紅梅  李艷春  鐘仁華  陳志

摘自：2014年04期《臨床與實驗病理學雜志》

病理組織標本的處理是病理技術中的關鍵，直接決定常規制片、特殊染色、免疫組化、原位雜交、PCR等一系列檢測的結果。一直以來，病理工作者均采用10%中******爾馬林作為組織樣本的固定液，用二甲苯對組織進行透明處理，這兩種試劑不僅污染環境，且對病理工作者的身心健康危害嚴重。因此，尋找一種既可以替代甲醛和二甲苯固定和處理組織樣本又對人體和環境沒有危害的試劑顯得非常必要。作者采用GS環保型組織固定及脫水試劑代替傳統試劑做了初步的、短期的實驗，主要包括組織處理后的石蠟包埋、HE染色、免疫組化染色以及Masson、PAMS、PAS等特殊染色。

1. 材料與方法

 1.1 標本

收集湖南省人民醫院2011年7-9月臨床送檢新鮮快速標本312例，冷凍快速診斷報告發出后，每例標本的病變組織分成兩份，一份用福爾馬林固定，傳統乙醇脫水、二甲苯透明，另一份用GS試劑固定、脫水及透明。該實驗所取的組織包括肝臟、甲狀腺、乳腺、腎臟（包括腎臟穿刺標本）、膽囊、結腸、胃、淋巴結、子宮、卵巢、胰腺、腦組織、肺組織、畸胎瘤等。

 1.2 儀器與試劑

  1.2.1 主要儀器 

LEICA ASP300S 全自動脫水機、湖北泰維TB-718D2型生物組織自動包埋機、HSANDON FI-NESSE325石蠟切片機、HSANDON Varistain Gemini自動染色機。

  1.2.2 主要試劑

GS環保固定和脫水試劑由哈爾濱格林公司研制并生產，所有檢測的抗體及免疫組化試劑盒EliVi-sion均購自福州邁新公司。

 1.3 方法

  1.3.1 組織處理

標本充分固定后取材，1.5cm×1.5cm×0.2cm大小，然后進行脫水、透明及浸蠟處理。傳統福爾馬林固定、乙醇脫水、二甲苯透明及浸蠟程序與GS環保試劑處理程序分別按常規步驟和GS試劑說明書操作進行。另外腎穿刺活檢標本也用兩種方法進行處理，進行實驗比較，由于腎穿刺標本較小，我們采用手工單獨處理，具體程序如下：傳統方法：乙醇-甲醛固定液（甲醛：95%乙醇為1：9）固定約26h，70%乙醇40min，80%乙醇40min，95%乙醇60min，無水乙醇60min，二甲苯20min，浸蠟40min；GS試劑處理步驟：固定液固定約26h，脫水液I60min，脫水液II60min，透明液20min，浸蠟40min。

  1.3.2 全自動HE染色法 

組織經脫水、透明、浸蠟處理后用自動包埋機包埋，石蠟切片機切片，約4μm厚切片，其中腎臟穿刺活檢組織約2μm厚切片。然后用自動染色機進行HE染色。兩份標本HE染色程序一致，具體操作步驟如下：（1）切片于70℃烤片10min后經二甲苯I、II、III脫蠟各3min；（2）無水乙醇、90|%乙醇各2min，自來水洗1min；（3）蘇木精染8min，自來水洗1min；（4）0.5%鹽酸分化5s，自來水洗10min；（5）0.5%水深性伊紅染色10s；（6）70%乙醇、95%乙醇各10s，無水乙醇I、II各2min，二甲苯I、II各2min，中性樹膠封固。

  1.3.3 特殊染色

本組實驗采用PAS、Masson、PAMS及Go-mori銀染法分別檢測腎臟、結腸癌、扁桃體和肝臟等組織中的基膜、中性黏液、免疫復合物及網狀纖維。具體染色步驟均參考《臨床技術操作規范病理學分冊》中的方法進行。

  1.3.4 免疫組化

采用IliVision Super/HRP法檢測結直腸癌、胃癌、乳腺癌、膽管細胞癌、肝細胞癌、乳腺癌、甲狀腺癌、腎細胞癌、子宮頸癌、子宮內膜腺癌、星型膠質細胞瘤、扁桃體等組織中40余種抗原的表達，包括CK（AE1/AE3）、CK5/6、CK19、CK7、CK20、CK5、CK34、Hepa-1、G1Y-3、RCC、p120、E-Cadherin、CD68、TTF-1、villin、CDX-2、CEA、CA199、D2-40、CD34、CD31、SMA、actin、S-100、Syn、NSE、CgA、GFAP、ER、PR、C-erbB-2、P63、CD20、CD45RO、CD3、CD79a、BCL-2、BCL-6、Cyclin、D1、Ki-67、p53、PCNA。

2. 結果

 2.1 脫水、透明、浸蠟及HE染色 

312例GS試劑處理的組織與傳統方法處理的組織相比，未發現脫水不佳及變硬、主脆等不良現象，切片與攤片效果均較好。HE染色結果顯示：胞質和胞核染色均勻一致，對比鮮明，結構清晰，但組織稍有收縮，細胞間有少許裂隙（圖1）。石蠟塊保存半年后未發現組織冊陷、發霉等現象，且HE染色仍然良好。

 2.2 特殊染色

結果顯示陽性物質定位準確，色澤鮮艷：PAS染色可以清晰地顯示腎小球基膜及結腸癌組織中的中性黏液；Masson染色可顯示腎小球的免疫復合物；PAMS染色可顯示腎小球基膜及系膜：Gomori銀染顯示扁桃體、肘臟網狀纖維染色良好（圖2）。

 2.3 免疫表型

GS試劑處理的標本絕大部分抗原保存良好，陽性信號強、定位準確，無背景染色，與傳統方法處理的標本染色效果一致。對40余種抗原進行檢測，發ER、PR和Hepa-1的染色效果弱于傳統方法，甲狀脫組織中TTF-1抗原染色不著色（圖3）。

     

     圖1 GS環保型固定、脫水試劑處理標本HE染色結果：A1.GS(扁桃體；A2傳統方法（扁桃體）；B1.GS（平滑肌瘤）；B2.傳統方法（平滑肌瘤）；C1.C2.GS（乳腺癌）；C3.C4傳統方法（乳腺癌）  圖2  GS 環保型組織固定、脫水試劑處理組織特殊染色結果：A1.GS處理腎組織，Masson染色；A2.傳統方法處理腎組織，Masson染色；B1. GS處理腎組織，PAMS染色；B2.傳統方法處理腎組織，PAMS染色；C1.GS處理結腸癌組織，PAS染色；C2.傳統方法處理結腸癌組織，PAS染色；D1.GS處理扁桃體組織，Gomori銀染法；D2.傳統方法處理扁桃體組織，Gomori銀染法。

       

圖3 GS環保型組織固定、脫水試劑處理組織免疫組化染色結果：A1.GS處理結腸癌（Ki-67)；A2.傳統方法處理結腸癌（Ki-67)；B1.GS處理乳腺癌（C-erbB-2)；B2.傳統方法處理乳腺癌（C-erbB-2)；C1.GS處理乳腺癌（PR）；C2.傳統方法處理乳腺癌（PR）；D1.gs處理肝臟（Hepa-1)；D2.傳統方法處理肝臟（Hepa-1)。

3. 討論

    采用甲醛固定、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋組織的病理技術已經使用100余年，組織處理完畢后進行常規HE染色、特殊染色、免疫組化染色，均能獲得滿意的結果，能滿足病理診斷的要求；傳統方法處理的組織其DNA保存較完整，可以進行PCR、原位雜交等分子病理檢測。但是，從環保、健康的角度來看，傳統組織處理及制片過程中使用甲醛和二甲苯對工作人員和外界環境造成很大的毒害和污染。在臨床病理工作中，理想的組織固定及脫水試劑應該是******環保，對組織和細胞結構、蛋白質、DNA以及RNA保存良好，且在較長時間內蠟塊無凹陷、DNA和RNA無降解，HE染色、特殊染色、免疫組化染色及原位雜交等分子病理檢測均能取得滿意結果。

    目前，國內外已有用無醛無苯環保試劑進行組織處理及制片的相關報道。作者采用哈爾濱格林公司研發的GS環保試劑與傳統試劑進行初步比較，結果顯示：GS試劑組織滲透性強，可以縮短脫水時間；能較好地保持組織及細胞的結構，不易導致組織脫水不徹底和過度收縮；能完整的切取各種不同厚度要求的切片；HE染色著色均勻，色澤鮮艷，胞質、胞核紅藍分明。PAS、Masson、PAMS、Gomori銀染等特殊染色分別清楚地顯示基膜及中性黏液、腎小球免疫復合物、腎小球基膜和系膜、網狀纖維等陽性物質，且定位準確，與田玉旺等的結果一致。此外，實驗也發現GS試劑能很好地保存組織聽部分蛋白質，免疫組化染色強度與傳統方法處理結果類似，定位良好。但采用不同的修復溫度、時間和pH值對ER、PR和Hepa-1重復染色后發現GS試劑處理的組織染色強度弱于傳統方法，與文獻報道結果類似。同眉頭主腺組織中TTF-1抗原未染色，可能與抗原種類有關，可以嘗試通過檢測不同公司提供的心想事成、不同克隆號的抗體、摸索抗原修復方法等來解決。

    通過環保型GS組織樣本制備液和傳統試劑處理組織制片后的HE染色、特殊染色以及免疫組化等一系列初步比較分析，發現染色結果均能滿足病理診斷的要求，該環保試劑可以替代傳統試劑用于病理組織固定、脫水處理。我地進一步通過原位雜交、PCR等方法檢測GS試劑對核酸（DNA和RNA）的保存效果及GS試劑長期固定標本后對常規制片、免疫組化‘原位雜交、PCR等檢測是否有影響。

 

參考文獻

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