GS環(huán)保試劑在骨髓病理石蠟包埋制片技術(shù)中的應(yīng)用

王華  繆勇建

廣西醫(yī)科大學(xué)******附屬醫(yī)院病理科

骨髓穿刺組織石蠟包埋制片技術(shù)在病理技術(shù)工作中是重點(diǎn)，也是難點(diǎn)。組織固定、脫鈣、脫水是***基本***重要的一個(gè)步驟。多年以來(lái)，病理科一直使用乙醇二甲苯作為常規(guī)組織脫水劑、透明劑；二甲苯是一種具有強(qiáng)烈刺激性的揮發(fā)性液體，不僅污染環(huán)境，更危害人體健康；對(duì)環(huán)保與人體健康的關(guān)注，需要一種對(duì)人體無(wú)害安全并且能保持組織處理質(zhì)量的環(huán)保替代品，作為病理技術(shù)工作中理想的脫水透明劑。本文就GS環(huán)保試劑對(duì)骨髓組織脫水透明常規(guī)HE染色制片、免疫組化檢測(cè)及原位雜交檢測(cè)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

 1. 材料和方法

  1.1 材料

選擇廣西醫(yī)科大學(xué)******附屬醫(yī)院病理科骨髓穿刺活檢標(biāo)本15例。其中大致正常骨髓2例，增生性骨髓4例，骨髓瘤4例，骨髓發(fā)育異常綜合癥（MDS）4例，NK/T細(xì)胞淋巴瘤骨髓累及1例。

  1.2主要儀器

Shandon Pathcentre全自動(dòng)脫水機(jī)，Shandon Finesse切片機(jī)，櫻花全自動(dòng)HE染色機(jī)，美國(guó)ThermoBrite Abbott公司原位雜交儀。

  1.3試劑

GS環(huán)保固定脫水試劑（由哈爾濱格林標(biāo)本技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司研制并生產(chǎn)），免疫組化試劑（一抗北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，二抗上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司），EBER原位雜交試劑盒（PanPath公司）。

 2. 方法

  2.1固定與脫鈣

40例骨髓穿刺標(biāo)本均進(jìn)行4%中性緩沖甲醛******次固定24小時(shí)，10%硝酸甲醛脫鈣液脫鈣30分鐘。

  2.2組織脫水

采用GS環(huán)保固定脫水試劑處理 ，步驟如下： = 1 \* GB3 ① GSA01（Ⅰ）2h，GSA01（Ⅱ）1h； = 2 \* GB3 ②70%乙醇40min，80%乙醇40min；  = 3 \* GB3 ③GSA02（Ⅰ）1h， GSA02（Ⅱ）40min； = 4 \* GB3 ④GSA03（Ⅰ）1h，GSA03（Ⅱ）40min；⑤GSA04（Ⅰ）1h，GSA04（Ⅱ）40min；⑥GSA05（Ⅰ）40min；GSA05（Ⅱ）50min；⑦GSA06（Ⅰ）1h，GSA06（Ⅱ）1h，石蠟包埋，切片，厚1.5微米。

  2.3 HE染色

日本櫻花公司全自動(dòng)HE染色推薦程序染色。

  2.4免疫組化染色 

采用SupervisionTM鼠兔通用二步法進(jìn)行免疫組化染色，增生性骨髓檢測(cè)CD3，CD20，CD43，CD61，CD68，MPO，KI-67；骨髓瘤檢測(cè)CD38，CD138，KI-67，CD20，CD79a；骨髓發(fā)育異常綜合癥檢測(cè)CD3，CD20，MPO，CD138，CD117，F(xiàn)8；NK/T細(xì)胞淋巴瘤骨髓累及檢測(cè)CD2，CD3，CD5，CD7，CD4，CD8,GrB,CD56；具體染色步驟同常規(guī)。

  2.5 ISH檢測(cè)

NK/T細(xì)胞淋巴瘤骨髓累及應(yīng)用PanPath公司EBER原位雜交試劑盒,參照試劑盒說(shuō)明書推薦的步驟操作。

 3. 結(jié)果

使用GS環(huán)保固定脫水試劑處理的20例標(biāo)本，在切片中感覺(jué)組織塊軟硬適中，切片厚薄均勻，薄切時(shí)連續(xù)性好，切片平整。GS環(huán)保固定脫水試劑處理的骨髓組織中各系骨髓細(xì)胞常規(guī)HE染色效果好，細(xì)胞形態(tài)完整，著色好，細(xì)胞收縮不明顯，核漿對(duì)比清晰，粒系細(xì)胞胞漿中嗜酸、嗜堿、嗜中性顆粒清晰可見(jiàn) （圖A、B、C）。各項(xiàng)免疫組化染色，細(xì)胞抗原性保存好，陽(yáng)性結(jié)果定位準(zhǔn)確，背景清晰（圖D、E、F、G）。一例NK/T細(xì)胞淋巴瘤骨髓累及進(jìn)行EBER原位雜交檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié)果準(zhǔn)確定位在腫瘤細(xì)胞核，陽(yáng)性信號(hào)清晰，背景干凈（圖H ）。

 4.討論

骨髓病理是臨床病理診斷中的重要的一個(gè)部分，也是一個(gè)難點(diǎn)。造成骨髓組織診斷困難有幾個(gè)原因：(1)正常骨髓細(xì)胞成分復(fù)雜，各系細(xì)胞處于不同的發(fā)育階段形態(tài)特點(diǎn)多樣；(2)淋巴造血系統(tǒng)疾病復(fù)雜多變，骨髓穿刺的組織少，增加了病理診斷的難度；(3)骨髓組織必須經(jīng)過(guò)脫鈣處理后才能進(jìn)行脫水石蠟包埋制片，脫鈣處理對(duì)保持骨髓的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成一定的影響。

傳統(tǒng)使用10%中******爾馬林作為固定液、乙醇二甲苯作為脫水透明劑，對(duì)組織滲透能力強(qiáng)，固定均勻，因此過(guò)去很長(zhǎng)時(shí)間作為病理科常規(guī)固定脫水劑；但在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，使用乙醇二甲苯作為脫水透明劑處理骨髓穿刺組織，骨髓組織硬化明顯，骨髓細(xì)胞收縮較大，導(dǎo)致切片厚薄不均，切片不平滑，難以切薄片等現(xiàn)象。骨髓病理石蠟制片的好壞不但與組織固定存在著密切的關(guān)系，也與組織的脫水透明有重要的關(guān)系。固定脫水透明的效果不但直接影響骨髓病理石蠟切片HE染色的質(zhì)量，更有可能免疫組化與原位雜交檢測(cè)的結(jié)果。隨著分子病理學(xué)的不斷發(fā)展，基因檢測(cè)等新技術(shù)的應(yīng)用也對(duì)固定組織的質(zhì)量要求越來(lái)越高，因此，選擇一種安全有效的固定脫水透明試劑處理組織以達(dá)到******狀態(tài)，對(duì)骨髓病理診斷非常關(guān)鍵。

病理實(shí)驗(yàn)室將二甲苯作為透明劑使用，它極易揮發(fā)，是一種對(duì)人體具有較強(qiáng)毒害作用的有機(jī)化學(xué)試劑。其毒性主要是刺激皮膚和眼睛。靶器官為胎兒、呼吸系統(tǒng)以及神經(jīng)中樞系統(tǒng)。反復(fù)接觸，產(chǎn)生神經(jīng)毒性效應(yīng)（記憶力下降、協(xié)調(diào)不良、情緒波動(dòng)和******性神經(jīng)損傷）。普通的手套材料不能提供充分的保護(hù)^[1,2]。采用GS環(huán)保型試劑對(duì)骨髓穿刺組織進(jìn)行固定脫水透明，對(duì)組織滲透力強(qiáng)，透明劑較溫和，處理組織軟硬適中，不易使組織變硬變脆，骨髓組織出現(xiàn)收縮和硬化現(xiàn)象明顯減輕，取得了理想的制片效果。

參考文獻(xiàn)

[1] John D, Bancroft, Marilyn Gamble ．組織學(xué)技術(shù)的理論與實(shí)踐[M]．周小鴿、劉勇主譯，北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2010，25-26.

[2] 高蓉梅，彭鳳翔，李永春．TO型生物制片透明劑取代二甲苯在病理制片中的應(yīng)用[J].診斷病理學(xué)雜志，2009，12（2）:147.

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