GS組織樣本與常規組織處理提取DNA的效果比較

GS組織樣本與常規組織處理提取DNA的效果比較

張進華  王爽  齊魯

廣州南方醫科大學病理系

近20年來，現代分子生物學技術越來越廣泛地被用于人類疾病研究的諸領域，為了解病理狀態下基因組DNA的變化積累了更多新資料。醫院病理科檔案中積存的大量石蠟包埋組織，是一個可靠的分子生物學研究的材料來源。在石蠟切片上進行原位雜交或原位PCR分析的分子生物學方法，是免疫細胞化學技術的重要延伸。通過對DNA或mRNA分析亦可直接證實或補充免疫細胞化學的發現。Goelz（1985）和Dubeau 等（1986）成功地從蠟塊中提取出高質量的DNA，完全可以滿足某些腫瘤分子生物學研究的需要，結束了DNA研究依賴于新鮮或冰凍組織和細胞的歷史，而且可以廣泛地應用于大宗病例的回顧性研究，對腫瘤發生的分子機制的探討、診斷與鑒別診斷研究有重要意義。

近年來隨著人們環保意識的提高，格林GS標本推出的組織固定脫水系列套裝試劑，減少或完全替代甲醛和苯系化學毒害試劑。我們用GS標本系裝試劑列套，制作的石錯切片提取DNA。PCR擴增、瓊脂糖電泳結果分析。并與常規固定脫水包埋作的石錯切片進行比較沒有差別。格林GS標本推出的組織固定脫水系列套裝試劑能較好保存病理組織中的DNA。主要步驟：取結腸癌、卵巢粘液腺癌，移行細胞癌，肝癌、胰腺癌、鱗狀細胞癌、乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢非粘液癌各6塊。GS標本系裝試劑列套處理。常規甲醛乙醇處理各6塊，方法如下:

組織固定液	1000ml/4000ml
GSB—01	組織固定液
GSB—02	組織脫水液Ⅰ
GSB—03	組織脫水液Ⅱ
GSB—04	組織透明液
GSB—05	組織浸蠟液Ⅰ
GSB—06	組織浸蠟液Ⅱ
GSA—01	組織固定液
GSA—02	組織脫水液Ⅰ
GSA—03	組織脫水液Ⅱ
GSA—04	組織透明液

 

 

GS組織樣本制備程序

序號	1	2	3	4	5	6	→
步驟	固定液	脫水液Ⅰ	脫水液Ⅱ	透明液	浸蠟液Ⅰ	浸蠟液Ⅱ	組織塊
產品 編號	GSA-01 GSB-01	GSA-02 GSB-02	GSA-03 GSB-03	GSA-04 GSB-04	GSA-05	GSA-06	包埋
手工 用時	過夜	1h30min	1h30min	2h30min	2h30min	過夜

 

DNA提取方法的主要步驟：

格林GS標本推出的組織固定脫水系列套裝試劑與常規處理的上述標本分別按下列方法提取：

1、每種蠟塊切 8微米厚的石蠟切片5張裝在2mLEp管中加入1mL二甲苯，振蕩混勻10s，室溫全速離心2min，棄上清，加入1mL無水乙醇，充分混勻，室溫全速離心2min，棄上清。打開Ep管蓋，37℃孵育10min，或直到殘余乙醇全部揮發。

2、在已脫蠟的組織切片管內加入500 μLTET溶液和30μL蛋白酶K，37℃水浴過夜。

3、在已消化過夜的組織中加入500μL Tris-飽和酚，充分振蕩，4℃ 13 000 r/min離心10min，取上清，加入250μLTris-飽和酚、250 μL氯仿/異戊醇(24∶1)，輕輕翻轉10 min，4 ℃ 13 000r/min離心10 min，取上清并加入1mL預冷的無水乙醇及30μL3mol/L NaAc，充分混勻，-20℃過夜。4℃13 000 r/min離心15 min，棄上清。向Ep管中加入1mL體積分數為75%的乙醇，輕輕翻轉3min，4℃   13000r/min離心15min，棄上清，室溫干燥20min或直至酒精完全揮發，加入50μL TE緩沖液溶解DNA(-20 ℃保存) 取的DNA 經OD值測量。計算OD260 /OD280比

 

PCR反應步驟：

格林GS標本推出的組織固定脫水系列套裝試劑與常規處理的上述標本分別按下列方法擴增。（1）向PCR反應管中依次加入格林GS標本推出的組織固定脫水系列套裝試劑與常規處理的結腸癌、卵巢粘液腺癌，移行細胞癌，肝癌、胰腺癌、鱗狀細胞癌、乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢非粘液癌提取的DNA模板 100ng (約為105拷貝DNA)引物(3'→5'，5'→3')各 2μl 10μmol/L (終濃度為0.4μmol/L)dNTP 2μl 5mmol/L (終濃度為0.2μmol/L)10×PCR緩沖液 5μl 1/10體積 (終濃度為1×)MgCl2 3μl 25mmol/L (終濃度為1.5mmol/L)Taq DNA聚合酶 0.5μl (終濃度約1～5U/μl)ddH2O 補到終體積為50μl，混勻后，離心15 s使反應成分沉于管底。(2) 加入礦物油30μl（2～3滴），以避免反應液蒸發，然后將反應管置于95℃（變性）5min。(3) PCR的循環程序一般為：94℃～96℃變性30s， 50℃～55℃退火30～60s，72℃延伸(1kb/1～2min)，循環25～30次。末次循環結束后，將反應管置于72℃溫育5min，以確保充分延伸保存 4℃ 。
    4、將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

（1）瓊脂糖電泳

格林GS標本推出的組織固定脫水系列套裝試劑與常規處理的上述標本分別按下列方法擴增試劑：

5ⅹTBE溶液：54gTris，27.5g硼酸，4.6g EDTANa₂溶于去離子水中，定容至1L。電泳時10倍稀釋使用。

5ⅹ上樣緩沖液：用5×TBE溶液配制0.5%溴酚藍，再加等體積甘油混勻。

溴化乙錠溶液：5mg/ml的溴化乙錠，避光保存。

0.8%瓊脂糖，用1×TBE溶液配制。

   （2）器材

電泳儀、水平電泳槽、紫外分析儀。

操作方法：

?瓊脂糖溶液的制備：配0.7%瓊脂糖，在沸水浴中煮沸直到完全溶解；將溶液冷卻到約50~60℃，加入溴化乙錠到終濃度為0.5ug/ml。

?將瓊脂糖溶液倒入電泳支架上，放上梳子，梳子須離開電泳支架底部1mm左右。待凝膠凝聚后，小心拔去梳子，將支架放入裝有電極緩沖液的電泳槽中，電極緩沖液應淹沒過膠。

?電泳

取薄膜，滴加上樣緩沖液和格林GS標本推出的組織固定脫水系列套裝試劑與常規處理的結腸癌、卵巢粘液腺癌，移行細胞癌，肝癌、胰腺癌、鱗狀細胞癌、乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢非粘液癌提取的DNA樣品10ul，混勻，用微量移液器加入樣品槽中。點樣端朝負極，通電。電壓為10v/cm。至溴酚藍移到距邊1cm處，取出凝膠，紫外燈下檢測。

結果

PCR擴增DNA片段只是一個重要手段，擴增片段的檢測和分析才是目的，瓊脂糖凝膠電泳可鑒定擴增產物的大小和特異性與敏感性；經格林GS標本推出的組織固定脫水系列套裝試劑制備的1、結腸癌   2、卵巢粘液腺癌  3、移行細胞癌   4、肝癌   5、胰腺癌    6、鱗狀細胞癌   7、乳腺癌   8、子宮內膜癌   9、卵巢非粘液癌。

結果：

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討論

格林標本—新一代環保型病理組織標本固定脫水透明試劑在病理組織標本制作中不但能增加對組織軟化，而且滲透性更強。對組織固定的同時，兼有脫水、脫脂的兼容性。pH值在6.5～7.0，微偏酸，對保存DNA效果很好。從實驗結果看和常規制片沒有差異。完全可以滿足某些腫瘤分子生物學研究。醫院病理科檔案中積存的大量石蠟包埋組織，是一個可靠的分子生物學研究的材料來源。格林GS標本推出的組織固定脫水系列套裝試劑。能較好應用于病理組織標本；而且環保。對工作環境污染少。減少或完全替代甲醛和苯的毒害。是值得推廣的環保試劑。

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